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本人对果树杂交比较感兴趣，特转发刘老师的论文，以便邦友们学习和讨论。大家可以各抒己见，尤其是有嫁接杂交经验的邦友，为大家奉献知识和招法！在此先谢谢大家！请发贴者文明发贴，可以争论，但绝对不可以曝粗口。
果树嫁接杂交及其应用
刘用生 (河南职业技术师范学院,新乡453003) 摘 要 介绍了目前果树嫁接杂交研究的概况,并对嫁接杂交在果树遗传研究和育种实践中的重要作用作了论述。 关键词 嫁接杂交;嫁接杂种;嫁接嵌合体;嫁接蒙导法;果树遗传育种 嫁接杂交是指通过嫁接方法来传递遗传性和获得杂种的过程。在《动物和植物在家养下的变异》一书中,达尔文首次提出嫁接杂种的概念,并列举了亚当金雀花、比莎利亚橙等许多植物嫁接杂种的事实[1]。米丘林在长期果树育种实践的基础上,创造了嫁接蒙导法(即过去通常所说的无性杂交),并对嫁接杂交在果树遗传育种中的重要意义做了大量论述[2]。在相当长的一段时间内,人们对嫁接杂交存在着不同的认识,并发生过激烈的争论[3]。本文将简要介绍近年来嫁接杂交研究方面的一些情况,并根据米丘林过去的大量工作和现代生物科学取得的成就,从新的角度对嫁接杂交在果树遗传育种中的重要作用作一论述。 1 果树嫁接杂交研究概况 1.1 中国古代果树嫁接杂交的记载 《本草纲目》中有“李接桃而本强者其实毛,梅接杏而本强者其实甘”的记载[4]。这就是说,李果实本无毛,但当桃(砧木)在年龄、长势上强于李(接穗)时,则李受到桃的影响,果实上出现了桃所具有的绒毛。梅子本不甜,但嫁接后受到杏(砧木)的作用,使其果实由酸变甜。这说明砧木和接穗的年龄不同,发育状况不同,能够影响到性状的改变。这与后来米丘林的嫁接蒙导法十分相似。《本草纲目》中还有“核仁入药,当取解核者种之为佳,山桃仁不堪用……。大抵佳果肥美者,皆圃人以他木接成,殊失本性。入药当用本生者为佳。今市肆卖者,
多杂接核之
仁也,为不堪也。”说明自根桃树与嫁接桃树的桃仁在药性上是有本质差别的。宋代的《种艺必用》上有“桃、李取核种之,经接者(嫁接过的)核不堪种”和“果实凡经数次接者,核小,但其核不 可种耳。”[5] 就是说从嫁接树上采下的种子长成的树不能保持原来品种的特性。1.2 对嫁接杂交研究中几个问题的不同认识 嫁接杂交属于无性杂交的范畴。虽然现在人们对通过原生质体融合和基因工程等无性途径来传递遗传性的理论和实践已普遍接受,但仍有一些学者对嫁接杂交持有怀疑甚至是否定的态度,或存在片面性的认识。1.2.1 关于嫁接杂种存在的真实性问题 达尔文、米丘林等著名科学家的大量工作早已证明了嫁接杂种的存在[1,2]。Pandey根据大量资料,从理论上证明了嫁接杂种存在的真实性[6]。Ohta和Yagi**a等在各自的嫁接杂交试验中获得了辣椒、茄子等蔬菜作物的嫁接杂种[7,8]。孟昭璜等将绿豆嫁接到甘薯上,获得了薯绿豆新品种[9]。也有一些学者否认嫁接杂种的存在。前苏联的克拉耶沃依认为不存在嫁接杂交的生物学机制,因而自然界也就不存在什么嫁接杂种[10]。杨世杰等根据“由矮化砧木引起矮化的苹果枝条,如果再嫁接到海棠上,还是长成一棵高大的苹果树”的事实,认为“嫁接没有引起遗传物质的变化,所以就不能像有性杂交那样培育 出嫁接杂种”[11] 。这主要是忽视了嫁接繁殖与嫁接杂交的区别,因为二者所用的材料和方法是完全不同的。1.2.2 关于嫁接杂种与嫁接嵌合体的关系问题 一些学者认为,以往所谓的嫁接杂种实际上是嵌合体[12]。笔者认为这种看法是片面的,因为嫁接嵌合体是嫁接杂种的一种类型。嫁接杂交所用的方法不同,就会产生不同类型的嫁接杂种。由砧木和接穗接合部位愈伤组织产生的不定芽所形成的嫁接杂种,现在人们普遍地称之为嫁接嵌合体[13]。为了与嫁接嵌合体相区别,我们把采用嫁接蒙导法产生的嫁接杂种,暂称之为嫁接蒙导杂种;而把嫁接果树有性后代形成的嫁接杂种,暂称之为嫁接有性杂种[14]。1.3 嫁接杂交机理的研究不同类型的嫁接杂种,其形成的机理是不同的。1.3.1 嫁接嵌合体形成的机理 嫁接时,砧木和接穗双方接口处的愈伤组织相互掺杂,由此愈伤组织发生的不定芽,由于它包含了砧木和接穗双方不同遗传成分的细胞,因而构成了一个兼具砧木和接穗双亲特点的嫁接嵌合体。这些嫁接嵌合体不仅能表现两种嫁接成分所具有的性状,而且常呈中间性状,甚至产生新的性状。如柑桔嫁接嵌合体中的‘枳和芦’,其叶片出现了单叶、二出复叶和三出复叶,其中二出复叶在砧木和接穗中都不存在。吕柳新等认为可能存在砧、穗成分之间染色质和细胞质的转移,转移的结果不仅导致生理上的影响,也可能存在基因互作[15]。1.3.2 嫁接蒙导杂种形成的机理 早在1933年,米丘林就指出,采用蒙导法进行嫁接杂交的 机理可能是“接穗的基因同砧木的基因混杂起来了”[2] 。Ohta和Pandey认为嫁接蒙导法诱导变异的机制与高等生物的转化机制相似[16,17]。Ohta对砧木拍摄的显微照片显示,砧木木质化和死细胞中呈现大小和形状不同的染色质通过胞壁和胞间隙向维管束运动,他认为砧木死细胞中的染色质转移并整合到接穗生长点细胞的染色体组中,从而使接穗产生遗传性变异[7]。因此,嫁接蒙导杂种形成的机理主要是嫁接转化。1.3.3 嫁接有性杂种形成的机理 嫁接有性杂种既不是从接合部位愈伤组织中产生,也非采
用嫁接蒙导法培育而成。嫁接繁殖时,由于接穗取自遗传性稳定的栽培品种,在发育阶段性上 是老龄的,其体细胞具有稳定的结构,不容易接受外来遗传物质,因此,一般能保持其遗传特性。而当接穗开花结果时,它产生的生殖细胞和早期胚胎细胞尚不具备正常细胞壁,处于不稳定状态(或者说感受态),容易接受外来遗传物质的影响。当砧木中的染色质片段转移并整合到正在分裂的接穗生殖细胞或早期胚胎细胞的染色体组中时,由此发育的种子便形成了嫁接有性杂种,其遗传物质来自父本、母本和砧木三方[18]。 1.4 嫁接杂交技术的改进 1.4.1 人工诱导嫁接嵌合体的技术 过去嫁接嵌合体多是在嫁接后由接合部位愈伤组织产 生的不定梢自然形成的,产生频率低。采用如下措施可以提高嫁接嵌合体的产生频率。(1)人工剪截法:这是Winkler创造的人工诱发嫁接嵌合体的方法[19]。即嫁接后将接穗从嫁接部位剪除,迫使嫁接部位愈伤组织形成不定梢,再从中选择嫁接嵌合体。(2)生长调节剂处理法: Ohtsu将用来嫁接的两个柑桔品种的珠心苗预先在实验室中进行暗培养,当幼苗长到7～9cm 高时,从下胚轴处靠接在一起,再光培养10d,使嫁接部位充分愈合,然后从嫁接部位水平切断,用50μmol?l-1GA3、1μmol?l-16-BA和1μmol?l-1NAA的混合液处理嫁接部位。这种诱发嫁接嵌合体的方法与一般方法相比,其诱导频率提高40倍[20]。(3)离体培养合成法:刘用生采用一项新的离体培养技术,它包括无菌苗的获得、试管嫁接、嫁接部位愈伤组织的增殖培养和从愈伤组织中再生植株的操作程序。采用这项技术,成功地实现了山楂与苹果的试管嫁接,并从愈伤组织中诱导出了试管苗,为诱发嫁接嵌合体提供了一种新方法[21]。 1.4.2 嫁接蒙导法的改进 米丘林最初采用的嫁接蒙导法,是从优良品种的结果树上采取接 穗,嫁接到杂种实生苗上,来促使杂种实生苗提早结果或改善幼龄杂种实生苗的品质。在这种情况下,接穗为蒙导者,砧木为被蒙导者。如果让接穗作为被蒙导者,砧木作为蒙导者,为了促进接穗发生变异,米丘林认为:第一,接穗必须在植物最早的生活阶段取下;第二,砧木的年龄应该较老;第三,在接穗所发育的新梢旁边,必须有大量的砧木新梢生长,以使砧木的根系和叶子共同影响接穗,同时还要减少接穗的叶子数量。只有具备这些条件,才能取得良好的结果[2]。后来,人们不断改进方法,如采用夹接蒙导法、重复蒙导法等。 2 嫁接杂交在果树遗传育种中的应用 2.1 嫁接杂交在果树遗传研究中的作用 与其它植物相比,果树有着特殊的遗传变异特点。以往在分析形成这些特点的原因时,许多学者忽视了果树主要靠嫁接繁殖这一事实,对嫁接的影响常常是视而不见或避而不谈。嫁接果树种子后代有以下几种表现: 2.1.1 种子后代出现很高比例的野生植株 根据多年的果树遗传育种经验,米丘林曾指出, “如果把某一个品种的嫁接果树作为母本,那么,由杂交所生出的实生苗,只有极少量具有杂交亲本品种特性的植株,其余大部分植株(有时高达95%)都是普通的野生种。”关于产生这一现象的原因,许多学者用返祖现象来解释,但米丘林认为,“这根本不是返祖遗传的影响,而几乎完全是由于老龄母本砧木植株极有力而稳定地影响了杂交所产生的极柔弱而在结构上没有形成稳定类型的杂种种子,就是说实际上我们所获得的是野生砧木和杂交亲本之间的嫁接杂
种”[2]。2.1.2 栽培品种种子后代经济性状普遍退化 大田作物品种间杂种在产量、果实大小及品质等经济性状方面多介于双亲之间,或在亲中值上下有一定的浮动。而主要靠嫁接繁殖的果树栽培品种间的杂种平均果重几乎毫无例外地都低于亲中值。景士西等曾对不同种类果树杂种的经济性状退化情况作过调查,如苹果杂种果的平均果重比亲中值下降18%～58%,品质级次下降16%～40%;梨杂种果的平均果重下降33%～51%,品质级次下降30%左右[22]。布尔班克曾在实验农场种植了20万棵来自最好的标准品种的苹果实生苗,只有12株略为突出地表现了优良的品质[23]。目前许多学者认为,根本原因在于营养系品种中非加性效应占有较大比重,有性过程中非加性效应解体,造成经济性状的普遍退化[22]。但米丘林认为,“根据我许多试验和观察的结果,我明确认识到一个事实,就是在杂交工作中用自根营养的植株要比用嫁接的植株好得多。假使以自根营养的植株作为亲本所产生的杂种,和以嫁接在野生砧木上的植株作为亲本所产生的杂种并排的种在一起,只要一看就会使人马上很深刻地感觉到前者的构造要比后者好得多[2]。2.1.3 质量性状的分离较多地偏离孟德尔比率 要在果树中寻找性状是3∶1或9∶3∶3∶1等分 离的例证非常困难。如桃的制罐品种通常要求黄肉、不溶质和粘核,这三个性状国内外几乎都认为是隐性性状,但事实并不完全是这样。如江苏省农业科学院园艺研究所报道在13个黄肉的杂交组合中有4个组合出现0.8%～3.7%的白肉株系;中国农业科学院郑州果树研究所报道不溶质×不溶质组合的杂种中,溶质类型占39.6%;庄恩及报道粘核×粘核5个组合中有2个组合出现离核单株12%～19%。现在一些学者认为,产生上述现象的原因是由于群体内个体间存在不同的多修饰基因复合体[22]。刘用生等认为,罐桃同质结合的隐性类型杂交所出现的显性后代,与许多嫁接杂交中出现的情况相类似[18]。 根据米丘林过去的大量工作,并结合现代生物科学取得的成就,刘用生等建议要重视对米丘林理论和实践的重新研究。并提出,砧木中的遗传物质转移并整合到接穗生殖细胞或早期胚胎细胞的染色体组中,可能是果树遗传背景复杂性的主要原因之一[18]。2.2 嫁接杂交对果树有性杂交育种的指导作用 有性杂交至今仍是主要的果树育种途径。过去由于对嫁接杂交的忽视,未能发挥其对有性杂交育种的指导作用,使得有性杂交育种仍然带有很大的盲目性,育种效率很低。对此我们今后必须予以深切注意。2.2.1 对杂交亲本选择的指导作用 米丘林曾多次强调,在果树有性杂交育种中,一定要注意杂交亲本的选择。“母本植株必须尽量培植自生根幼树,这种树产生的优良品质的实生苗, 比嫁接树所能产生的,要多4倍”[2] 。当然,果树主要靠嫁接繁殖,要寻找自根系的植株是不容易的。米丘林采用培养自生根母本植株的办法是:事先将嫁接品种的接穗嫁接在挖开土的砧木上,随后将接穗埋入接合部位之下2俄寸的土中,以便诱发接合部位以上的部分生根,经过2～3年时间,待幼树形成自己的根系后,再把它移植,同时把野生砧木的根截断[22]。现在看来,这种方法较为费事,我们可以采用组织培养方法来培育作为杂交亲本的自根苗。2.2.2 对杂种实生苗提早结果的指导作用 由于果树杂种实生苗具有较长的童期,因此,如何使杂种实生苗提早结果,缩短育种周期,一直是育种工作者所关注的问题。布尔班克积极倡导采用高接法来使实生苗提早结果。他曾
在一棵大苹果树上嫁接了526个杂交苗接穗,认为这不仅能使果树育种所需的时间比不用高 接法所需时间节省一半有余,同时还能节约大量土地[23]。目前在杂交育种实践中,高接法已成为促进杂种实生苗提早结果的一个常规措施。 米丘林也曾应用过高接法来促使杂种实生苗提早结果,但后来发现这样做往往导致不良后果,即由此培育的品种,其品质会变劣,经过仔细的观察研究,他认为“幼龄品种的品质恶化应当归咎于上面接有成年栽培品种的野生砧木的影响,即已经成年的果树砧木,通过以前嫁接的栽培品种很大的中间部分,对新嫁接在树冠上的尚未形成本身稳定性的幼龄品种,发生了影响。这样,老龄树冠上的那些杂种实生苗接穗,将不再是从种子培育出的那个品种,而是砧木 和接穗之间的嫁接杂种了”[2] 。因此,米丘林多次提醒果树育种工作者不要将幼龄杂种实生苗的接穗高接在具有野生砧木的成年栽培品种树冠上。有时为了提早结果,可以将优良品种的成年枝条嫁接在幼龄杂种实生苗上,待诱导开花结果后立即将接穗去除[2]。 从上述嫁接蒙导法的机理看,我们认为米丘林的建议是正确的。因此,在今后的果树杂交育种工作中,不宜再采用高接法来提早结果,否则将带来“欲速则不达”的后果。 此外,采用嫁接杂交和有性杂交相结合的方法,即预先无性接近法,可以有效地克服远缘杂交不亲和性,这已是人所共知的了。2.3 嫁接杂交作为一种简单实用的育种方法2.3.1 嫁接杂交育种的应用价值(1)培育丰富多采的果树嫁接嵌合体:嫁接嵌合体在生产上具有很大的利用价值,它集砧木和接穗双方于一体,往往产生砧、穗双方互补的性状。由于两种嫁接成分不同的组织排列能产生多种多样的表现型,可望培育出外皮抗病虫或色泽艳丽,内部营养丰富或味美质优的优良品种。在许多果树中都曾获得过嫁接嵌合体,其中在柑桔中出现的最多,如比莎利亚橙、Kobayashi蜜柑、Kinkoji蜜柑、Casella嵌合体、枸和桔、改良橙、红江橙、枳和芦等[15]。(2)培育类似转基因植物的嫁接蒙导杂种:米丘林曾指出,采用嫁接蒙导法,“可以使幼龄杂种苗木的性状和品质按照育种者的愿望,得到部分的改变,即有定向的去教养苗木,使它们的好品质得以提高并固定起来,而它们的那些向坏的方面发展的倾向及许多不良的品质可以被抑制,甚至完全消失。”例如,采用嫁接蒙导法可以“增加产量及果实的大小,使果 实具有生动的色泽和良好的冬季贮藏品质,提高果肉内糖的含量,以及使果树更能抗寒等”[2] 。米丘林也曾提醒果树育种工作者注意嫁接蒙导法的应用范围,认为嫁接蒙导法“仅在自根营养的而且是地道的杂种幼龄苗木上才有效,而不能应用于曾经嫁接在野生砧木上的或久经栽培 的老龄品种上”[2] 。 采用嫁接蒙导法培育的嫁接蒙导杂种实际上是一种特殊类型的转基因植物,它是将砧木 (或接穗)中有限的遗传物质导入接穗(或砧木)中,在某些方面比通过原生质体融合获得的体 细胞杂种和利用基因工程获得的转基因植物更为有益。因为通过原生质体融合把双亲的全部基因结合在一起并不是必要的,更多情况下则是有害的。如柑桔体细胞杂种的果实一般表现果皮粗、厚、种子多、汁液少,直接作为接穗品种显然是不现实的,只能作为砧木或用作杂交亲本[24]。采用基因工程导入的基因目前基本上都是单基因,而果树的许多重要经济性状都是由多基因控制的,难以解决育种的主流问题[25]。而且转入的基因多是原核生物的或人工合成的,这些基因在真核生物基因组中不稳定,容易被淘汰[26]。此外,某些转基因植物还存在安全性的潜在危险。嫁接蒙导杂种一般不存在上述问题。过去米丘林采用嫁接蒙导法曾培育出
梨苹果等10多个果树品种[2];后来前苏联和日本等国又培育出了许多品种[27];我国曾培育出了‘国帅’苹果[28]。 2.3.2 嫁接杂交育种方法的优越性和局限性 任何一种技术都不是万能和尽善尽美的。和 其它育种方法一样,嫁接杂交也有其优越性和局限性。 (1) 嫁接杂交育种方法的优越性:方法简单 嫁接杂交是目前最简单的育种方法,不需要巨 额投资和高级的仪器设备,一把嫁接刀和修枝剪足矣。这便于广泛开展群众性的育种工作。范围广—由于不同属间、种间的嫁接亲和力要比之有性杂交为高,因此,许多采用有性杂交不能成功的组合,采用嫁接杂交一般容易成功。这在远缘杂交育种中具有特别重要的意义。便于开展工作—有性杂交和“授粉后外源DNA导入植物技术”只能在短暂的花期进行,而嫁接杂交可在一年的大部分时间进行,温室和离体培养条件下还可周年进行。 (2) 嫁接杂交育种方法的局限性:诱导嫁接嵌合体方法的局限性 首先,有些果树如柑桔、李 等容易在自然或人工创伤处产生大量新梢,因此,从这些果树中容易诱发嫁接嵌合体,而其它果树采用一般方法还难以产生嫁接嵌合体。其次,在多种类型的嫁接嵌合体中,只有周缘嵌合体能在无性繁殖条件下保持稳定。此外,嫁接嵌合体的诱导频率一般较低。嫁接蒙导法的局限性 由于嫁接蒙导法的机理主要是将蒙导者的遗传物质转移并整合到被蒙导者中,这与“授粉后外源DNA导入植物技术”一样,具有较大的随机性,不如基因工程采用目的基因那样目的明确,也不如有性杂交出现的变异率高。 3 结 语 我国已故遗传学家方宗熙教授指出,“嫁接杂交可以丰富遗传学内容,在实践上和理论上开 辟了新的途径,值得进一步深入研究”[29]。我国著名科学家钱学森先生最近倡议开设一门技术性 科学———植物嫁接改造学,并指出它的作用决不亚于基因工程学[30]。近年来,基因工程倍受青睐而嫁接杂交渐遭冷落,在我国嫁接杂交研究处于无人问津的状态,从长远的观点看,对于有发展前途的基因工程进行投资研究是必要的,但也不能忽视果树育种工作自身存在的许多特殊矛盾。米丘林是位卓越的、务实的科学家,他在辛勤劳动的一生中不仅培育出了300多个果树品种,还总结出了许多理论和方法。遗憾的是,他的许多重要理论,尤其是关于嫁接杂交的论述,至今未受到应有的重视。我们认为,采用嫁接杂交,不仅能培育出丰富多彩的嫁接嵌合体,还能创造出类似转基因植物的嫁接蒙导杂种,方法简单实用。更值得注意的是,嫁接杂交对于揭示果树遗传规律和指导果树有性杂交育种工作也具有重要意义,值得进一步研究。
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