枣愈伤组织培养及其应用研究进展

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枣属（Ziziphus Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）最富经济价值的一个属，其中枣（Ziziphus jujuba Mill.）和酸枣（Z. acidojujuba C. Y. Cheng et M. J. Liu）分别是该属中主要的栽培种和野生种，具有重要的经济、药用和观赏价值，在我国农业经济发展及乡村振兴中占有重要地位。但是由于枣树胚败育率较高、花小且去雄困难、落花落果严重，大大限制了杂交育种在枣树新品种培育上的应用。利用愈伤组织进行诱变、悬浮细胞系建立、遗传转化等创制新种质在枣树上具有广阔的应用前景。因此，本文对近年来枣（酸枣）愈伤组织培养和利用现状进行综述，并对今后的工作进行了展望，以期为枣愈伤组织培养的技术优化和科学利用提供借鉴和参考。

PART ONE

枣不同组织的愈伤诱导培养研究

通常，进行愈伤组织诱导的外植体可以是胚、叶片、茎段、根、果肉等。同一品种的不同外植体或不同品种的相同外植体，其愈伤诱导的条件往往不同。在枣上，以茎段、叶片、花药和胚为外植体的愈伤诱导体系已建立起来，但尚未见以果肉为外植体诱导愈伤成功的相关报道。

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以茎段为外植体的愈伤诱导

以枣茎段作为外植体进行愈伤诱导的研究已有一些报道，发现基因型、基本培养基种类，尤其是生长调节剂种类和浓度组合对愈伤诱导效果具有重要影响。如豆玉娟等以朝阳地区无核枣未木质化的带芽茎段为试材，研究了不同浓度生长调节剂对愈伤组织诱导的影响，结果表明，在MS培养基上愈伤组织增殖的最佳生长调节剂组合为0.5mg/L TDZ＋0.1mg/L NAA；管少花以蜂蜜罐枣1~2cm长的带腋芽茎段为外植体研究发现，当其生长调节剂配比为0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L IAA时，出愈率可达到80%；刘晓光以1/2MS为基本培养基，发现适合冬枣组培苗嫩茎愈伤诱导的生长调节剂配比为3.0mg/L ZT＋10.0mg/L NAA。但是大部分的研究结果表明，同样的条件，在与其他外植体的生长状态和出愈率进行对比时，茎段的出愈率偏低，因此在以茎段为外植体进行诱导时，如何根据以往的研究结果对培养基进行优化处理，提高出愈率至关重要。另外，不同枣品种茎段愈伤诱导的适宜培养基组成有所差异，在进行具体品种的茎段愈伤诱导时需对培养条件特别是生长调节剂组合进行筛选，找出最适组合。

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以叶片为外植体的愈伤诱导

在枣上，以叶片为外植体进行愈伤诱导较为常见，也是相对较容易的，但诱导效果也会受到生长调节剂组合、基本培养基和基因型等因素的影响。如罗在柒等以狗头枣的叶片为试材研究发现，培养基为MS＋3.0mg/L TDZ＋0.5mg/L NAA＋2.0mg/L AgNO3＋30g/L蔗糖＋6.0g/L琼脂时，诱导2周后的出愈率可高达100%；周瑞金在对黄骅冬枣和辣椒枣以MS为基本培养基进行叶片诱导愈伤时，发现冬枣在1.0mg/L TDZ＋0.1~0.5mg/L IBA时可诱导产生愈伤组织，而辣椒枣的适宜生长调节剂组合为0.5mg/L TDZ＋0.1mg/L IBA。宁强等以冬枣组培苗的叶片为外植体，研究了MS、1/2MS和WPM 3种培养基对诱导愈伤的影响，发现MS培养基的诱导率高于另外2种培养基。但不同品种适宜的基本培养基类型存在差异，如周瑞金以辣椒枣叶片为外植体时，WPM培养基诱导愈伤的效果优于MS培养基。另外，魏薇等以月光枣、冬枣和木枣的叶片为材料时，发现1.0mg/L TDZ与0.1mg/L IBA组合，可使3个枣品种的出愈率均达到100%；相较于其他外植体而言，以叶片为外植体进行愈伤诱导虽较易成功，但也会受叶片的来源及诱导方式的影响。目前以叶片为外植体进行愈伤诱导的研究主要集中于培养基和培养环境方面的探讨，而具体的光质、湿度、温度等环境条件对其愈伤的诱导并未见过系统的研究。

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以花药为外植体的愈伤诱导

枣花药愈伤诱导是将花药在无菌条件下接种到培养基上，改变花药细胞发育途径，进而获得愈伤组织及再生植株，可作为遗传育种研究的重要材料，但是枣的花药培养难度较大，较易受基因型、取材时间、培养基以及附加成分的影响。韩晶以月光枣、长红枣等5个枣品种的花药为外植体进行了愈伤诱导，发现较适合其诱导愈伤的培养基成分有所差异，并且不同的基因型其诱导率也有所不同；武晓红等以赞皇大枣等5个品种的花药为外植体，通过调节生长调节剂的比例，得出不同基因型之间花药愈伤组织诱导率和分化率均存在显著差异，以阜平大枣的花药愈伤诱导率最高。另有研究者指出，花药培养的最佳时期是花蕾为五角逐渐变圆的黄绿色、花药为淡黄色的单核靠边期。段丽君等以冬枣花药为试验材料，通过探讨不同麦芽糖、生长调节剂及温度处理对花药培养诱导效果的影响，发现在MS＋1.0mg/L 2,4-D＋1.0mg/L 6-BA＋20g/L麦芽糖＋4g/L琼脂培养基上培养，其愈伤组织诱导率达到最高。但是在枣树上，花药愈伤诱导获得更多的是花药壁来源的愈伤组织，花粉来源的很少，且再生后获得的单倍体植株更少且难以成活。通过研究也发现，枣花药培养对基因的依赖性较强，并且部分基因型离体培养发育不全，因此，需要综合考虑多种因素选出较为适合研究的基因型，进而缓解花药培养效率较低等问题。

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以胚为外植体的愈伤诱导

胚败育问题在相当长的时期内严重制约了枣的杂交育种进程，在枣胚败育前进行离体培养获得再生植株可以很好地解决胚败育问题。进入21世纪以来，人们做了大量的枣胚培养（胚挽救）研究，并在多个品种或杂交后代上取得成功，推动了枣树杂交育种的开展。如张存智对陇东马牙枣盛花后50~60d的幼胚进行愈伤组织培养表明，Nitsch培养基＋1.0mg/L BA＋1.5mg/L 2,4-D＋30g/L蔗糖＋4.0g/L琼脂可诱导产生愈伤组织进而诱导出胚状体及再生苗植株；Ren等以冷白玉枣的幼胚为试材，利用其产生的愈伤组织筛选出适合其幼胚分化的培养基为MS＋0.8mg/L TDZ＋0.5mg/L IAA＋3%蔗糖，其分化率达到81.12%，有效提高了冷白玉未成熟幼胚的拯救效率。张梦玲以早脆王、板枣、长红、无核76等41个枣基因型的胚为外植体进行愈伤诱导，发现无核76在0.5mg/L NAA＋3mg/L TDZ生长调节剂组合下可以诱导大量愈伤组织。但是由于枣胚败育机理尚未清楚，加上枣树虽花期时间长，但单花开放时间较短的特性，导致枣胚培养进展相对来说较慢，因此，应该加强枣不同胚龄愈伤诱导范围，以此找出最小胚龄发育阶段，进而扩大研究材料，推进枣胚愈伤诱导研究。

PART TWO

枣愈伤组织的应用

愈伤组织是进行植物离体培养与生物技术研究的常用材料，可应用于枣树研究的多种领域，包括离体植株再生、多倍体诱导、遗传转化、突变体筛选、悬浮细胞系建立、原生质体的建立培养和细胞融合等（图1）。但枣（酸枣）愈伤在这些领域的研究应用还处于起步阶段，还有很大的优化和提升空间。

图1  枣（酸枣）愈伤组织的应用

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枣（酸枣）再生体系、愈伤途径植株再生和多倍体诱导

随着转基因技术的发展，枣属植物愈伤组织培养受到越来越高的重视。愈伤组织不仅可以诱导重新分化成整个植株，还在诱导多倍体和遗传转化等方面得到了实际应用。在枣组培再生体系方面，豆玉娟等以朝阳地区无核枣为试材，明确了适合其愈伤产生不定芽的培养基和生长调节剂组合为MS＋1.0mg/L TDZ＋0.2mg/L NAA；郭烨以已有的冬枣花蕾外植体所形成的愈伤组织进行再分化研究，发现在MS＋0.5mg/L TDZ＋0.1mg/L NAA＋30g/L麦芽糖＋5.9g/L琼脂培养基上，其分化明显，成功建立冬枣的愈伤再分化体系，获得再生植株；有研究表明，以叶片愈伤组织为材料诱导多倍体可以大大提高多倍体的诱导率。在枣组培利用愈伤诱导多倍体方面，王娜以冬枣叶片为研究材料，通过对愈伤组织进行秋水仙素诱变，成功获得了纯合四倍体植株；也有研究者利用混培法对冬枣组培苗叶片愈伤组织进行秋水仙素处理，但死亡率较高。在枣田间利用愈伤进行多倍体诱导方面，由于较易受外界环境及枝条生长状况等因素的影响，导致诱导率低，如李百云等以灵武长枣和中宁圆枣为试验材料，发现当把诱变剂的浓度控制在4mg/L时，其诱导愈伤等级最高，虽然验证了利用秋水仙素在田间诱导多倍体的可行性，但是其几倍体尚未确定；Shi等以37个枣（酸枣）基因型为研究对象，优化了利用枝干截口愈伤组织在枣（酸枣）体内快速诱导同源多倍体（IVIHA）的方法，成功获得了虹光等同源多倍体，这为利用枣田间愈伤进行多倍体诱导提供了更多的可能性。

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枣愈伤途径遗传转化

目前木本植物上常采用叶盘法进行遗传转化，此方法操作简单，适应性广且重复性高，但是转化周期长且工作量大。近年来，随着研究的不断深入，利用不同外植体诱导出的愈伤组织进行遗传转化逐渐成为研究的一大热点，此方法具有转化效率高、转化时间短等特点，已广泛应用于苹果、梨、柑橘、葡萄等调控果实品质相关基因的功能分析。枣树的遗传转化研究起步较晚，但近年来取得了明显进展。郝征以冬枣的叶片为试材将双抗虫基因和蛋白抑制剂基因转入冬枣中，获得了8个转基因植株。罗在柒以壶瓶枣再生材料为受体，进行虎杖白藜芦醇合成关键基因PcPKS5的遗传转化，经Basta筛选、GUS显色、gDNA PCR、RT-PCR检测验证，成功获得3个转基因阳性株系。Chen等利用叶盘转化法成功获得抗枣疯病转基因幼苗。但利用愈伤组织直接进行遗传转化，效果更好，如李亚梅等以酸枣实生苗叶片诱导出的愈伤组织为受体材料，成功获得转ZjBRC1-SRDX基因愈伤组织，并初步探讨了ZjBRC1对生长素合成关键基因ZjYUCCA表达调控的影响。冯晓东等利用胚培养14 d的骏枣愈伤组织，以农杆菌LBA4404（含有pART-GF1-2）进行侵染，通过PCR检测，在9个遗传转化批次中得到2个批次的转基因植株。李敏以不同枣基因型组培苗所获得的愈伤组织为试验材料，成功地将ZjAC2基因整合到枣基因型5-9-12-5-28中，并利用LUV-30A进行了荧光鉴定。

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利用枣愈伤组织建立悬浮细胞系

状态良好的松散愈伤组织，还可以在液体培养基中培养进而建立悬浮细胞系。细胞悬浮培养包含一个相对均匀的细胞群，可以快速、均匀地获得营养，常用于激素、细胞信号转导和次级代谢产物等研究。张梦玲以生长旺盛、状态一致的无核76的胚性愈伤组织为试材，利用剪好的枪头吸取分散的小细胞团及单细胞并将其转移到液体培养基中进行悬浮振荡培养（培养温度为27℃，暗培养，以150r/min进行回旋式振荡），继代周期为5~7d，经过5~6次的继代培养，成功建立了生长状态较为稳定的悬浮细胞系（图2），并且通过此悬浮细胞系揭示了枣环磷酸腺苷代谢的调控机制。枣悬浮细胞系研究虽然处于起步阶段，并较易受到培养条件等方面的影响，但无核76悬浮细胞系较为稳定，对于后续利用其进行相关次级代谢产物合成及遗传转化研究提供了更大的可能性。

图2  枣悬浮细胞系的建立流程

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利用枣愈伤组织进行原生质体培养和细胞融合研究

原生质体是一种去除细胞壁后由细胞膜包裹的原生质团，具有生命活力，可用于研究蛋白质功能、信号转导、转录调控、细胞过程和多组学分析等。原生质体的制备通常是通过不同外植体所诱导愈伤摇出的悬浮细胞系获得。目前，已有大量研究利用枣悬浮细胞系为材料，通过分析甘露醇、纤维素酶、离析酶的浓度或者是酶解时间、离心速度、离心时间及环境等因素的影响，成功制备出产量及活力均高的原生质体。如刘晓光以冬枣组培苗叶片和花药愈伤组织悬浮系为材料，通过研究不同的甘露醇、纤维素酶以及离析酶的浓度和其酶解时间、离心速度和离心时间等因素对原生质体分离的影响，找到了原生质体产量和活性均较好的方法。邢东方以灰枣为试材，成功建立了灰枣叶片原生质体分离纯化体系，获得了产量及活力高的原生质体。齐向英等以狗头枣组培苗叶片为试材，通过全面分析不同的酶解浓度及不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响，发现当酶液配比为1.0g/L纤维素酶、0.4g/L果胶酶、0.6mol/L甘露醇以及在黑暗环境下酶解8h可获得大量有活力的原生质体。王林霞以无核76的悬浮细胞系为试材，利用酶解法成功分离出原生质体，并且利用聚乙二醇（PEG）介导转化法将ZjIQD16基因转化到原生质体中，对于后续利用其进行相关生物学功能研究奠定了基础。另有研究表明，将CRISPR/Cas9基因组编辑技术与原生质体再生技术相结合，将会以前所未有的方式促进重要植物遗传改良的能力。

原生质体融合技术为枣新种质的创建提供了新方法。原生质体融合技术作为现代生物技术的重要组成部分，已广泛地应用于生物科学众多领域的研究，打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种质的限制，并扩大了遗传物质的重组范围。早在1999年，何业华等以无核小枣和鸡蛋枣的胚性悬浮细胞为材料，进行原生质体制备并进行细胞融合成功再生获得了完整的植株。近年来，关于枣原生质体培养方面的研究虽有相继报道，但是关于枣细胞融合方面的研究极少。

PART THREE

枣愈伤组织培养研究与应用展望

当前，枣愈伤组织培养有了很大进步，但仍需进一步优化和熟化，特别是在应用方面还有很大的提升空间。

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加强基于愈伤组织的枣多倍体诱导和遗传转化研究

2000年以来，枣树离体多倍体诱导虽然取得了显著进展，获得了一批人工加倍的四倍体。但是研究发现，多倍体诱变容易受诱变材料、诱变时间、诱变剂浓度的影响，尤其是田间茎尖诱导多倍体极易产生嵌合体和混倍体，形成纯多倍体的概率极低，其中在枣树的多倍体诱导中，多选用茎尖及叶片等作为诱导材料。另外，研究表明，以叶片愈伤组织为材料诱导多倍体可以大大提高多倍体的诱导率，叶片因其厚度较薄，用秋水仙素处理较易渗入叶片内部，并且在预培养阶段，叶片内细胞分裂期同步性强，不易造成嵌合体或混倍体问题。因此，在后续的多倍体研究中，可以尝试多以枣的叶片为材料，通过调节其激素和营养比例，加大利用组培愈伤诱导多倍体的研究力度，尝试以多个材料为研究范围，克服诱导率加倍困难等问题，找出诱导多倍体最通用的方法。此外，利用枣愈伤组织进行遗传转化虽然有了一定进展，但转化过程中易受基因型、农杆菌侵染浓度和时间等因素影响，效率偏低且不够稳定。因此，进一步提高枣愈伤途径多倍体诱导和遗传转化的效率应作为今后研究的重点，特别是要通过大规模基因型筛选找到容易转化的材料，并大幅度提高愈伤组织遗传转化的稳定性和简便性。

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加强基于愈伤组织的枣悬浮细胞高效培养体系完善及其应用研究

悬浮细胞系是一个良好的模型系统，可在单细胞及细胞间水平上开展诸多研究，并可高效生产生物碱、蛋白质、糖类、天然色素等重要代谢产物。目前，利用枣愈伤组织进行的悬浮细胞系研究主要集中于悬浮细胞系建立上，利用其开展细胞水平的研究还比较少，用其进行遗传转化研究及进行重要营养和功能成分的高效生产尚未见报道。今后应进一步熟化枣悬浮细胞培养体系，提高悬浮细胞繁殖效率，并加强相关的基础和应用研究，特别是要弄清愈伤组织中营养物质含量与外植体营养物质含量的关系及如何通过调控培养基和环境条件（温度、光强、光周期等）来提高愈伤组织中营养物质含量。

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加强基于愈伤组织的枣原生质体分离培养体系熟化及其应用研究

虽然原生质体已成功应用于瞬时基因表达、蛋白质亚细胞定位、蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、细胞对激素响应的信号通路、转录调控网络等研究，但由于原生质体分离难度大，分离技术不成熟，尚不能达到在所有植物的所有组织和器官中分离出活的原生质体，而且持续培养、融合、再生的难度更大。目前，枣原生质体分离培养研究主要集中于如何制备产量高和活性强的原生质体，其应用方面的研究报道极少。今后应加强枣原生质体融合、再生和多倍体新种质创制研究，并利用制备出的原生质体开展生理生化、基因表达、蛋白互作、信号应答、转录调控等研究。

声  明：本文摘编自《中国果树》2023年第1期“枣愈伤组织培养及其应用研究进展”（赵若雨，郭晓雪，朱文慧，李瑞梅，刘志国，王立新，刘孟军）。欢迎个人转发分享，其他任何媒体和网站如需转载，须在正文前注明来源：中国果树。

不上岸不改名

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mkr759

太专业，看不懂，帮顶一下

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