利用SSRs法识别果树品种

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利用SSRs法识别果树品种
                                                          —一种可实际应用于品种识别的方法

                                                    轩海波，Manfred Buechele
                                            KOB公司，拉文斯堡，德国
      序言：经验丰富的果树学家大多利用茎与萼的深度、萼片、果核、种子、维管束、果皮、果浆、生长、叶状、枝干颜色等果树的物候性状来识别果树品种。然而，由于产地、砧木、栽培措施和天气状况的不同，一些物候性状很容易发生变异。因此就使得果树品种的识别工作变得异常复杂。而且，突变育种中不断增加的变异使得用传统的品种识别方法在通常情况下无法区分出其不同之处。随之，违反植物种类权利许可的情况便会发生，或不遵守适当的质量控制程序。
自2004年4月，KOB已参与了INTERREG IIIA Bodensee-Alpenrhein-Hochrhein领域内的一项国际性工程以保护该工程区域内发现的古老的石榴品种。这些品种的物候期识别是通过采用KOB提供的遗传指纹法来实现的。

      遗传指纹法是一种程序，其中可用于分析的有苹果、樱桃、李子、坚果等各个植物组织，能够通过找出已知的DN段（标记、基因位点）而识别。这样，对单个果树品种典型的DN段就可以相互间进行比较。如图1所示四种苹果品种之间的“血缘关系”。

      在KOB公司遗传指纹法是通过微卫星序列法（SSR）完成的。大约有300个来自Lake Constance地区的古老苹果品种保存于KOB资源圃中，并且都是利用该方法进行遗传分析的。这样一来，之前由DNA指纹识别的品种就能够保存并用于证实未知苹果的种类的识别结果。
原则上，该方法同样有可能用于新上市的品种，KOB正是利用这一方法对德国食品零售贸易及其他有关政府部门进行质量控制。目前， SSR技术识别樱桃品种的方法正被用于与LVWO的合作中。
苹果1      苹果2     苹果3      苹果4
图1. “指纹”的表现
这是利用单基因标记（基因位点）进行识别的例子。片段1A-5A为不同的等位基因并可以通过采用一对基因标记进行分析。该图可以解释为：苹果3为苹果1与苹果2的杂合种。苹果4与苹果2具有半“亲缘关系”。

      材料及方法

—样本
      生长状况良好的果树新鲜叶子、一年生枝条、花蕾、树皮、根、果实等即除种子与已凋谢的花外植物的所有组织都可以用于品种识别。现在，从什锦水果或果汁中提取DNA仍处于试验阶段。所有样本被立即使用，或者在－32℃的冷冻室内保持冻干状态直到分析时使用。
—提取与量化
      基因组DNA是依据CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）吸附法提取出来的。该方法是国际通用且具有可重复性。
DNA提取物是通过SERVA数字图象、DIAS-I'分析系统（见图片1）进行量化的，之后被稀释到1-5 ng/μ用于分析。
—通过聚合酶链反应（PCR）扩增基因
      为使得果树品种能够特征化，从ETH、苏黎士及国际物种遗传库的CH-SSR-标记系列选出微卫星标记（SSR标记）。一组SSR标记包含两种引物。其中一个引物由该基因20-30个碱基对构成，如，“CH02g09-SSR标记”包含一个上游引物-tca gac aga aga gga act gta ttt g 与一个下游引物-cca aca aac cag tac cgc aa.

      图片1.SERVA数字图象与分析系统DIAS-I’。决定DNA提取物中DNA浓度的装置。
利用聚合酶链反应（PCR）可以实现两种引物结合位点之间的DN段的大量扩增。除此之外，两种引物均结合于匹配DNA序列，这样，复制过程便开始了。一个向前，一个向后。当二者相遇时，该复制过程结束，下
一轮的复制过程又开始了。两个结合位点之间的DNA序列由此而重复复制，直至该DN段的数量可用于分析测量。图片2所示的是自动完成聚合酶链反应（PCR）的装置。

     图片2.热循环槽，可以完成目的片段扩增的装置。

—DN段分析
      将聚合酶链反应（PCR）产物置于毛细管测序仪（CEQ 8000）。图2所示为测量结果之一。随后，将所得结果转换到一个Excel文件，在特殊电脑软件(BioSciTec-软件)的帮助下对以上数据进行聚类分析以得到亲缘关系的系统图像。

结  果

—Braeburn及富士苹果突变株的分析结果
      对6个Braeburn苹果及2个富士苹果突变种用含12 对引物的12 对（遗传位点）基因进行遗传分析，指纹结果如表1所示。表1数据显示的是碱基对（bp）（遗传物质单位）中片段的长度。‘Braeburn'与 ‘富士’为双倍体，即同一位点最多可能有两个值且两个数之间存在一个最大值。因此，对于每一个基因位点（遗传位点），。一个基因位点上一个数值（例如，‘富士 Kiku 8’基因位点6的218）表示该基因位点为纯合，两个数（例如，'Braeburn Lochbuie'基因位点1上分别含有108和164） 表示该基因位点为杂合。

图2. 四个品种的比较
表1. 利用微卫星法（SSR）对Braeburn与富士苹果突变株的分析结果
Loci 1 基因位点1
Loci 2 基因位点2
Loci 3 基因位点 3
Loci 4 基因位点 4
Loci 5 基因位点 5
Loci 6 基因位点 6
Loci 7 基因位点 7
Loci 8 基因位点 8
Loci 9 基因位点 9
Loci 10 基因位点10
Loci 11 基因位点11
Loci 12 基因位点12
Braeburn Lochbuie Braeburn Lochbuie（德国品种）
Braeburn Nakb Braeburn Nakb（德国品种）
Braeburn Redfield Braeburn Redfield（德国品种）
Braeburn Joburn Braeburn Joburn（德国品种）
Braeburn Huwell Braeburn Huwell（德国品种）
Braeburn Schneide Braeburn Schneide（德国品种）
Fuju Kiku 8 Fuju Kiku 8号（日本品种）
Fuju Raku Raku Fuju Raku Raku（一种日本经济品种）
      如表1所示，从突变种所得到的片段是相同的。这意味着 SSR方法还不适用于这些物种突变株的识别，因为尚未发现不同品种的突变种内所含的不同的遗传位点。只要知道了这些遗传位点，以上突变种的引物使用就能够取得成功。

—甜樱桃品种的比较
      该技术的发展是在KOB为研究甜樱桃时而开发的。取自Weinsberg、Bendorf以及Stuttgart三家研究所的33个样品结果如表2所示。与大多数苹果品种一样，甜樱桃也是双倍体，因此，每一个经过分析的基因位点中的两个数值中总存在一个最大值。这近乎成为了一种规律。
表2所示结果表明：
-  来自Weinsberg的‘Noire de Meched’ 品种的W49和W46是相似的。
-  L47, W48, W54 及W103 可识别为‘Vanda’， 其他树(L48, W51, W50，W100, W101 and W102)均不正确，可以将其归类为未知品种。
-来自以上三个研究所的“甜心”与 ‘Sumste’两个品种是类似的。
-来自Bendorf 的‘卡林娜’ (BVK7)与来自Weinsberg的‘卡林娜61510’ (W52)不同，但与‘奥克塔维亚’ (BVK1)相似。
-斯基纳/Gi5’ (BVK11)与W109,、W110以及BVK5不同。
-来自Stuttgart的‘Giorgia’与Weinsberg的同类苹果不同。因此对以上品种进一步核实并采用更先进的方法是必需的
—酸樱桃品种与其砧木对比
酸樱桃属于四倍体品种。在每一个被检测的基因位点中，如品种‘Cigany meggy 7’中，同一位点最多有4个不同的数值。尽管基因位点7（与来自德国Dresden植物育种研究所的Schuster博士的私下交流）存在四个数值，然而根据组型分析，‘Giesela 5’砧木为三倍体。结果如表3所示。
来自Weinsberg 的‘Cigany meggy 7’品种与斯图加特的此类品种是相似的。
2005和2006年，‘Gisela 5’的2个样品及‘Gisela 5’的一个不确定样品被送往KOB做遗传分析。这些样品是通过12对SSR标记进行分析的，同时于2005年及2006年发现‘Giesela 5’品种与‘Giesela 5’不同。
结  论

      凭借SSR方法，利用指纹可以进行两种未知的品种的比较。通过数据库内已确认品种的指纹可以识别已知或不确定的品种。作为惯例，该方法是在KOB公司苹果中实施的，而甜樱桃与酸樱桃尚处于试验阶段。目前正在准备梨、李子、覆盆子、无花果、杏以及桃子的指纹测试，预计于2008年完成。
      KOB基因数据库中目前已存有约300个古老苹果品种的指纹。至今，已识别了几个不确定或者同物异名的品种。利用这种方法对从Bendorf收集到的品种进行了再分析，并识别了取自德国其他研究所的一些品种。通过不断地扩充基因数据库的品种，将来便会出现一种可靠的品种识别服务以用于生产实践、植物育种、苗圃生产以及质量控制。KOB将为商贸经营者提供了一种“合法的”果树品种识别服务。
表2 来自Weinsberg (W), Stuttgart (L) and KOB (BVK)三个研究所

甜樱桃品种对比
Name 名称
Lab. Z Z实验室
Loci 1 基因位点1
Loci 2 基因位点2
Loci 3 基因位点 3
Loci 4 基因位点 4
Loci 5 基因位点 5
Loci 6 基因位点 6
Loci 7 基因位点 7
Loci 8 基因位点 8
Loci 9 基因位点 9
Loci 10 基因位点10
Loci 11 基因位点11
Loci 12 基因位点12
Noire de Meched (Ertragsbaum) Noire de Meched (Ertragsbaum)（德国品种）
Noire de Meched (SoKo) Noire de Meched (SoKo)（德国品种）
Vanda, echt 万带兰, echt（德国品种）
Vanda, falsch 万带兰, falsch（德国品种）
Vanda 61511 万带兰61511（德国品种）
Vanda 61690 万带兰61690（德国品种）
Vanda (Jungbaum) 万带兰(Jungbaum) （德国品种）
Vanda (Ertragsbaum) 万带兰(Ertragsbaum) （德国品种）
Vanda (falsch) Gräb 万带兰(falsch) Gräb（德国品种）
Vanda (falsch) Jork 万带兰(falsch)乔克
Vanda (falsch) Holovousy 万带兰(falsch)
Vanda (echt) Jork 万带兰(echt)乔克
Sweetheart 甜心
Sumtare (Sweetheart) Sumtare（甜心）
Sweethaert I 甜心1号
Sweetheart II 甜心2号
Sweethaert I 甜心1号
Sweetheart II 甜心2号
Sweetheart 61690 甜心61690
Sumste (29-1-0-0-1) Sumste (29-1-0-0-1)
Samba (61690) Samba (61690)
Sumste (Samba) Sumste (Samba)
Samba Samba
Karina 61510 卡林娜61510
Karina 卡林娜
Oktia 奥克塔维亚
Skeena (61690) 斯基纳(61690)
Skeena (61510) 斯基纳(61510)
Skeena 斯基纳
Skeena/Gi5 斯基纳/Gi5
Giorgia (61690) 乔治亚(61690)
Giorgia 乔治亚
Merchant (61690) 麦钱特(61690)
Merchant 麦钱特
表3 Weinsberg (W), Stuttgart (L) and KOB (BVK)
研究所酸樱桃品种与其砧木对比
Name 名称
Lab. Z Z实验室
Loci 1 基因位点1
Loci 2 基因位点2
Loci 3 基因位点 3
Loci 4 基因位点 4
Gisela 5 甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)5号
Gisela 甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)
Gisela 甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)
Cigany meggy 7 Cigany meggy 7号
Cigany meggy 7 Cigany meggy 7号
Loci 5 基因位点5
Loci 6 基因位点 6
Loci 7 基因位点 7
Loci 8 基因位点 8
Loci 9 基因位点 9
Loci 10&n
bsp;基因位点10
Loci 11 基因位点11
Loci 12 基因位点12