[新手教程]草莓脱毒苗入门

图南 · 发表于 2023-1-2 00:22

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写在前面:
本文需要一定的生物基础才能理解，不要来杠我，杠就是你对。如果有错，欢迎指出。

如果你懂，欢迎大佬指点。如果你不懂，我的建议就是麻烦不要建议。

这么多年好像从未在这个论坛看到过有讲草莓脱毒技术，最近也算是学习了一个阶段，感觉也是有所心得了，所以浅浅的讲一讲我的理解。

一.脱毒的理论依据

1.病毒从遗传物质上可以具体为两种，rna病毒和dna病毒。最近口罩问题很严重，新冠就是一种rna病毒，rna病毒是以单链的rna为遗传物质，所以遗传物质不稳定，容易发生变异，这也是为啥这么多变种的原因。除了这两种病毒，其实还有一种特别的，疯牛病的元凶朊病毒就是另类。

病毒无细胞结构，它没法独自完成生命活动。但是它可以把自己的遗传物质注入细胞，从而实现生命活动。

2.在植物生长旺盛的区域，生长很快，病毒浓度很低甚至是没有病毒。在植物的根尖，茎尖等部位，生长很快，不容易有病毒。现在的脱毒技术基本都是用茎尖进行组培从而实现脱毒。

3.取来进行组培的植物切块称为外植体。在草莓脱毒技术当中，外植体的大小是决定脱毒成功与否的关键因素。外植体取0.5毫米以下的尺寸时，脱毒率比较高。但是取得太小以后，成活率会很低很低。

4.脱毒成功与否可以用pcr来检测。

二.所需器材与试剂

1.器材
无菌操作台、高压灭菌锅、生物显微镜、体式显微镜、移液枪、烧杯若干、手术刀、手术剪、镊子、组培置物架、耐高温封口膜、耐高温胶圈、组培瓶、试剂瓶若干、报纸、酒精灯等等

这里面除了无菌操作台不能嫖二手的，其他基本都能嫖二手的。只不过要买二手东西，动手能力要强，初高中物理生物知识要到位。

我买的生物显微镜拿回来问题一大堆，灯不亮，卡尺损坏，光路有斑。最后都是自己弄好的。

弄好了效果也很不错

2.试剂

常用试剂:无水乙醇、75%乙醇、盐酸、氢氧化钠、次氯酸钠、ms培养基、柠檬酸、活性炭、琼脂

常用激素:iaa,naa,6-ba,kt

在草莓组培脱毒技术里面，需要的就只有naa和6-ba。激素拿回来，先配置成母液，母液的配置在前文中有讲，这里就不赘述了。

这里要注意，kt不稳定，不能高温灭菌。kt常常在木本植物组培中有用到（这句不保证对，看得文献还不够多）。

三.具体操作

1.我们在做草莓组培脱毒的时候，需要采用的部位是草莓走茎。我们首先需要知道草莓走茎的结构。第一步，我们先将草莓走茎总双片刮胡刀并在一起切片，然后制片后用生物显微镜观察。我们需要的是草莓走茎的茎尖，我们就需要知道茎尖在什么地方。

2.知道茎尖结构以后，我们就可以进行实操了。

（1）.培养基的配置
在草莓组培脱毒技术中用到的培养基分了三类:诱导培养基、增殖培养基、生根培养基。

以下所有ms均指带琼脂和蔗糖的成品ms培养基

诱导培养基:ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l
ph5.5

我们这一步是要进行诱导培养基的配置，按照说明书加ms培养基到沸水里面搅拌就好。然后在冷却之前，算好所需要的激素量以后，用移液枪加入激素母液。最后再以氢氧化钠定ph。

这里我们可以买ph计，也可以买ph试纸。

如果买ph试纸的话一定要买精确的，5到7那种ph试纸。

我被ph试纸卡了半个月，因为不懂ph试纸能不能测试缓冲物质。

3.灭菌

在培养基凝固之前，将培养基分装在组培瓶中。（也可以灭菌后分装）

然后将烧杯装上水，装3烧杯，用透气封口膜封口。

置物架、手术刀、镊子、剪刀、以及上面的培养瓶和烧杯，以及大小合适的牛皮纸用报纸包裹上。

灭菌锅中加水，将报纸包了的所有材料及工具放于灭菌锅中。关上锅盖，拧紧。插电，开始放气后计时十五分钟关掉。

等灭菌锅冷却以后，手戴手套喷酒精消毒，拿出灭菌锅中材料和器材放于已经打开吹风和消毒的无菌操作台上。

4.材料的处理

取新鲜健康粗壮的草莓走茎，用流水冲洗2小时左右。

打开操作台风扇和消毒开关，先消毒半小时以上。

冲洗好以后，点燃操作台中的酒精灯。将置物架，手术刀，镊子，剪刀等等工具，用酒精灯灼烧

取之前灭菌好的两个空烧杯，一杯装75%酒精，一杯装次氯酸钠或者升汞之类的外植体消毒剂。

先将走茎顶端剪五厘米放于酒精中消毒，30s以后取出用灭菌过的水清洗。再将清洗后的走茎放入4%的次氯酸钠溶液中，15分钟以后取出用无菌水清洗。

在体式显微镜下，用手术刀和镊子，将走茎顶端剥开，取0.3到0.4毫米的走茎顶端接种于诱导培养基中。

这一步，要注意垫上无菌纸后，在无菌纸上切。每操作一次以后，手术刀等工具要用火焰灼烧，冷却以后再使用。

5.将接种了草莓外植体的培养瓶，放在25度左右，光照强度1500～2000lux，每天光照时间14小时。培养50天左右，这个过程可以看到愈伤组织的产生以及萌发不定芽。

6.增殖培养

将诱导培养以后的丛生苗切开，接种到增殖培养基上。

增殖培养基:ms+6-ba0.5mg/l+naa0.01mg/l
ph5.8

培养环境:25度左右，2000lux，培养30天左右

7.生根培养

生根培养基:ms+naa0.3mg/l+0.3%活性炭+20g/l蔗糖

将增殖培养的苗子切成单根，接种在生根培养基上，培养环境与以上步骤相同。直到苗子生根。

8.驯化

取出装有已经生根了的种苗的瓶子，打开瓶盖在自然环境中24小时，让种苗适应环境。24小时后，取出小苗，清洗干净培养基，种植于基质上。

写在最后:

网上看了一圈所谓的教程，全是噶韭菜的玩意儿。有的人发个视频连消毒剂都要染色来迷惑别人免得透露自己所谓的“技术”，真是滑稽。

组培这玩意儿，如果只是照葫芦画瓢，做一些常见的植物，根本没得技术壁垒。我10月买器材，11月开始动手，被ph试纸卡了半个月，也就是11月下半月开始做。12月初就看到长叶子出来了。

操作壁垒倒还有一些，无菌操作之类的。

写了大半夜，累死了

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